對(duì)于厭氧細(xì)菌和古菌，在進(jìn)行取樣、分離和培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)均必須注重這類(lèi)微生物的特性，采用相適應(yīng)的方法，使采集的樣品具有代表性，盡可能保持其在原生境的種類(lèi)和數(shù)量，并通過(guò)分離和培養(yǎng)將其反映和顯示出來(lái)，同時(shí)取得所需的試驗(yàn)菌種。
本規(guī)程規(guī)定了厭氧細(xì)菌和古菌樣品采集、分離、培養(yǎng)的方法和要求。 厭氧細(xì)菌和古菌樣品采集、分離、培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程 1 范圍
本規(guī)程規(guī)定了厭氧細(xì)菌和古菌樣品采集的要求及根據(jù)樣品量的大小所應(yīng)采取的采樣方法；規(guī)定了厭氧細(xì)菌、古菌樣品分離和培養(yǎng)的具體方法。
本規(guī)程適用于不同生境中厭氧細(xì)菌和古菌樣品的采集；以及各類(lèi)厭氧細(xì)菌和古菌的分離培養(yǎng)。 2 術(shù)語(yǔ)和定義
本規(guī)范采用下列術(shù)語(yǔ)和定義。2.1 厭氧細(xì)菌和古菌 Anaerobic Bacteria and Archaea
厭氧細(xì)菌和古菌如梭菌屬（Clostridium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）等，是指要求在沒(méi)有分子氧條件下才能生活的各種細(xì)菌和古菌。本文所指厭氧細(xì)菌和古菌為專性厭氧細(xì)菌和古菌， 2.2 Hungate厭氧技術(shù) Hungate method
Hungate厭氧技術(shù)是美G微生物學(xué)家Hungate于1950年**的一套有效的用于厭氧菌分離和培養(yǎng)的技術(shù)，它包括培養(yǎng)基預(yù)還原和在無(wú)氧環(huán)境中進(jìn)行的菌株分離和培養(yǎng)操作技術(shù)。利用該技術(shù)，許多嚴(yán)格厭氧細(xì)菌和古菌的分離、培養(yǎng)獲得了成功。
2.3 厭氧手套箱 Anaerobic chamber (glove box)
厭氧手套箱利用預(yù)置在箱內(nèi)的鈀催化劑，催化氫氣與氧結(jié)合生成水，從而達(dá)到除去箱內(nèi)氧氣的目的。它包括操作室和交換室兩部分。操作室用于厭氧分離、培養(yǎng)，交換室用于操作室內(nèi)外物品的傳遞。 3 樣品采集
采集厭氧細(xì)菌和古菌樣品時(shí)，應(yīng)盡可能避免將樣品較長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,盡快將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)放置樣品所用容器的不同，可將樣品的采集方法分為：厭氧試管法、厭氧罐或厭氧袋法、棉拭子法三種，采集時(shí)應(yīng)視具體情況，選擇其中一種方法。 3.1 厭氧試管法 3.1.1 儀器和用具 3.1.1.1厭氧試管
帶丁基膠塞的可密封的試管、小瓶，或其他容器。可通入無(wú)氧氣（O2）的氮?dú)猓∟2）、二氧化碳?xì)怏w（CO2）、或氮?dú)狻⒍趸細(xì)怏w和氫氣的混合氣體（CO2、N2和H2），以置換管內(nèi)空氣，創(chuàng)造厭氧條件。 3.1.1.無(wú)菌注射器。 3.1.2 稀釋液
常用磷酸鹽緩沖液做為稀釋液（NaCl 0.85g，Na2HPO4 0.25g， NaH2PO4 0.56g，蒸餾水 100ml）。 3.1.3 取樣對(duì)于土壤、污泥等可大量獲得的樣品，可將樣品直接裝入滅菌的厭氧試管中，直**裝滿，塞上膠塞，擰緊螺口膠蓋。對(duì)于從動(dòng)物腸道、口腔等部位采集的少量樣品，直接將樣品迅速裝入滅菌的、盛有預(yù)還原稀釋液的厭氧試管內(nèi)，立即塞上膠塞，擰緊螺口膠蓋。對(duì)于液體樣品應(yīng)用無(wú)菌注射器抽取樣品，取樣后立即排除多余空氣，將樣品注射進(jìn)滅菌的厭氧試管中。 3.2 厭氧罐或厭氧袋法 3.2.1 儀器和用具 3.2.1.1厭氧罐或厭氧袋
可以密封的容器。利用化學(xué)方法，去除容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境。 3.2.1.2滅菌的平皿、三角瓶或試管 3.2.2 取樣
將樣品盡快裝入滅菌的平皿、三角瓶或試管等器皿中，然后放入?yún)捬豕藁騾捬醮鼉?nèi)。 3.2.3 棉拭子法
采取臨床樣品時(shí)常用此法。 3.3.1 儀器和用具 3.3.1.1厭氧試管
同4.1.1.1。 3.3.1.2棉拭子
無(wú)菌棉拭子，裝在厭氧試管中。 3.3.1.3半固體瓊脂培養(yǎng)基
去除氧氣的半固體培養(yǎng)基，分裝在厭氧試管中。 3.3.2 取樣
用棉拭子采樣后，直接插入裝有半固體培養(yǎng)基的厭氧試管內(nèi)。 4 樣品分離
厭氧細(xì)菌和古菌樣品的分離，通常采用系列稀釋滾管法或平皿涂布法。對(duì)于樣品中含量很少的微生物如光合細(xì)菌，應(yīng)先用富集培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離。 4.1 滾管法 4.1.1 儀器和用具 4.1.1.1 厭氧試管
同3.1.1.1。 4.1.1.2振蕩器
4.1.1.3無(wú)菌注射器、彎頭毛細(xì)管、乳膠管 4.1.1.4盛有冰塊的托盤(pán)或滾管機(jī) 4.1.1.5顯微鏡 4.1.2 稀釋液
同4.1.2。 4.1.3 滾管分離 4.1.3.1樣品稀釋
取1g或1mL（混合均勻的液體）樣品，置于裝有9mL或4.5mL預(yù)還原稀釋液的厭氧管內(nèi),在振蕩器上振蕩均勻，用無(wú)菌注射器取1mL或0.5mL樣品稀釋液加**另一裝9mL或4.5mL的稀釋液的試管內(nèi)。按此操作依次制備成10-1—10-9的樣品稀釋液，備用。 4.1.3.2滾管
將盛有無(wú)氧無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱**100℃，使瓊脂熔化，并保溫在50℃左右的水浴中，備用。用無(wú)菌注射器取**少3個(gè)稀釋度的樣品稀釋液0.1-0.2mL，加入盛有溶化的預(yù)還原培養(yǎng)基的厭氧試管內(nèi)，將試管平放于盛有冰塊的盤(pán)中或放在特制的滾管機(jī)上迅速滾動(dòng)，培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。適溫培養(yǎng)后，在瓊脂層內(nèi)或表面形成菌落。滾管前**好用顯微鏡觀察待分離的樣品，了解樣品中的細(xì)菌或古菌形態(tài)類(lèi)型及其濃度，作為分離樣品的參考。 4.1.3.3分離培養(yǎng)
挑取單菌落時(shí)，將形成單菌落的試管和一支盛有無(wú)菌、厭氧培養(yǎng)液的試管固定在適當(dāng)?shù)闹Ъ苌希サ粼嚬艿哪z塞，插入滅菌的注射器針頭，通入氣流速度適當(dāng)?shù)摹o(wú)菌的、高純氮?dú)狻o(wú)菌彎頭毛細(xì)管小心插入形成單菌落的試管內(nèi)，輕輕吸取預(yù)先作好標(biāo)記的單菌落，轉(zhuǎn)移**盛有厭氧培養(yǎng)液的試管內(nèi)，塞上膠塞，擰緊螺口膠木蓋，適溫培養(yǎng)。形成的菌落需及時(shí)進(jìn)行單菌落的挑取和移植，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養(yǎng)物，需再次稀釋、滾管，并再次挑取單菌落，直**獲得純培養(yǎng)物為止。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
分離的單菌落也可在厭氧手套箱內(nèi)挑取。 4.2 平皿涂布法 4.2.1 儀器和用具
4.2.1.1厭氧罐或厭氧手套箱 4.2.1.2玻璃刮刀 4.2.2 涂布分離
根據(jù)5.1.3.1中所述方法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，于厭氧手套箱中，取一定稀釋度的樣品稀釋液0.2-0.5mL置于瓊脂平板上，用玻璃刮刀涂抹均勻，置于厭氧罐或厭氧手套箱中，適溫培養(yǎng)。待形成菌落后，及時(shí)在厭氧環(huán)境中進(jìn)行單菌落的挑取和移植。
5 分離菌種的培養(yǎng)
分離得到的厭氧細(xì)菌或古菌，應(yīng)接種在適宜其生長(zhǎng)的厭氧培養(yǎng)基中，置于厭氧環(huán)境中，適溫培養(yǎng)。 5.1 儀器和用具 5.1.1 厭氧試管
同4.1.1.1。
5.1.2 厭氧手套箱、厭氧罐，或厭氧袋 5.1.3 細(xì)口圓底燒瓶 5.2 厭氧培養(yǎng)基的制備 5.2.1 制備
采用煮沸法去除培養(yǎng)基中的氧氣。將盛有已熔化的培養(yǎng)基（已加入氧化還原電位指示劑—刃天青（Resazurin））的細(xì)口圓底燒瓶，在酒精燈上加熱，煮沸培養(yǎng)基，同時(shí)通入純度為99.99%的高純氮?dú)猓鯕庖驯煌耆コ螅囵B(yǎng)基從紅色變?yōu)闊o(wú)色，此時(shí)加入規(guī)定用量的半胱氨酸。 5.2.2 分裝制備厭氧培養(yǎng)基的同時(shí)，將純度為99.99%的高純氮?dú)馔ㄈ肟盏脑嚬苤小Ｈコ嚬苤械难鯕狻⑸鲜鰺o(wú)氧培養(yǎng)基分裝進(jìn)厭氧試管中，塞上膠塞，擰緊膠木蓋，滅菌備用。
5.3 厭氧細(xì)菌和古菌的培養(yǎng)
將分離得到的厭氧細(xì)菌或古菌接種在適宜的厭氧培養(yǎng)基中，直接在厭氧試管中進(jìn)行培養(yǎng)，或者在可獲得厭氧環(huán)境的裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，如厭氧手套箱、厭氧罐或厭氧袋等。
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厭氧微生物的分離與培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
熟練掌握Hungate厭氧操作技能，了解和掌握厭氧微生物的培養(yǎng)基配制，并進(jìn)行分離純化。 二、實(shí)驗(yàn)用具
裝有分壓表的氮?dú)怃撈浚瑲錃怃撈浚{(diào)壓變壓器，銅柱和銅柱固定架，高壓滅菌鍋，厭氧管（15ml）,厭氧瓶(50ml)，異丁烯橡膠塞、電爐、圓底燒瓶（500ml、1000ml）、各種規(guī)格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#針頭，酒精燈，酒精棉等。 三、實(shí)驗(yàn)操作
(一)、高純無(wú)氧N2的制備
1、 接通電源：把輸出電壓緩緩從0伏分級(jí)升到50～90伏之間（調(diào)電壓的過(guò)程持續(xù)大約2-3s
就可以了）。大約20分鐘后，銅柱溫度能達(dá)到350℃左右（輸出電壓禁止長(zhǎng)時(shí)間超過(guò)90V以上，否則會(huì)導(dǎo)致銅玻璃柱變形直**破裂，甚**發(fā)生安全事故）。
2、 待銅柱溫度升**350℃左右時(shí)，加熱套觸摸起來(lái)比較燙，開(kāi)啟氫氣鋼瓶并形成氣流，使銅
柱內(nèi)的銅絲還原（反應(yīng)速率很快，幾秒鐘見(jiàn)效，還原與否可以從銅絲顏色的變化看到，同時(shí)柱內(nèi)會(huì)產(chǎn)生水蒸氣，氧化銅與氫氣反應(yīng)所致；通氫氣的時(shí)候**好打開(kāi)窗戶，一定熄滅操作臺(tái)邊上所有明火，包括酒精燈和電爐）。
3、 待銅絲被氫氣還原呈現(xiàn)純紫銅錚亮色，同時(shí)把里面的水蒸氣也排出完全后，關(guān)閉氫氣鋼瓶，
壓力表指針降為零；打開(kāi)氮?dú)怃撈浚瑲饬鞔笮∫园厌橆^對(duì)準(zhǔn)操作者手背5cm距離明顯感覺(jué)到氣流為宜，并隨時(shí)注意氣流是否足夠。
4、 使用完畢后，先關(guān)緊氮?dú)怃撈浚箟毫Ρ淼闹甘踞樆?*零位，接著關(guān)閉電源，使調(diào)壓變壓
器調(diào)節(jié)指示回**0伏處。 (二)、無(wú)氧無(wú)菌水的配制
1. 將500ml一定濃度的NaCl水溶液（防止稀釋時(shí)細(xì)胞漲破）沿玻璃棒倒入固定在鐵架臺(tái)
上的1000ml圓底燒瓶中（選擇合適的圓底燒瓶，水不可太滿，否則水沸騰時(shí)容易濺出），**好放入幾個(gè)防爆玻璃珠。向500ml水中加入終濃度為0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.5‰)。在燒瓶外壁溶液水平面處劃一刻度后，加入適量水（因?yàn)檎舭l(fā)會(huì)損失部分水分）。煮沸5-10min（視所加水總量而定），刃天青會(huì)根據(jù)水中含氧量的下降經(jīng)歷紫色-紅色-無(wú)色的顏色變化，當(dāng)溶液變?yōu)闊o(wú)色后，再煮沸5min，然后通高純氮?dú)?-2min（趕走空氣）。
2. 分裝的過(guò)程可以不用繼續(xù)加熱，用10ml的定量注射針筒抽進(jìn)氮?dú)饬鳎俅虺觯ㄈ我?/div>
上）洗氣，然后抽取9ml無(wú)氧水注入已換氣的15ml厭氧管中（抽取注射過(guò)程中應(yīng)迅速利落，與空氣接觸時(shí)間應(yīng)縮****短）；注入?yún)捬豕芎螅枰却?s-10s，以置換瓶中空氣，在抽出氮?dú)饬麽橆^的同時(shí)塞緊異丁烯橡膠塞（操作要*：抽出針頭時(shí)要注意，橡膠塞應(yīng)該先半扣到瓶口，然后用右手食指撳住，左手捏住通氣針頭慢慢抽出針頭，橡膠塞可能會(huì)外翻導(dǎo)致漏氣等，此時(shí)將針頭往瓶?jī)?nèi)伸，使塞子恢復(fù)原樣，有時(shí)需要反復(fù)多次，視塞子大小而定，**后拔出針頭，拔出同時(shí)立即將塞子塞進(jìn)管口），**后旋緊蓋子。 3. 121℃高壓蒸汽滅菌20min。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（三）、專性厭氧菌液體培養(yǎng)基配制（以制備1000ml為例）
1、 按照配方配制培養(yǎng)基，定容后，加入1ml的1‰刃天青母液（W/V）(終濃度0.001‰)，0.4g
的半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.4‰)，用NaOH或KOH調(diào)節(jié)pH值（resazurin和半胱氨酸對(duì)培養(yǎng)基的pH有影響，應(yīng)加入后再測(cè)pH）。
2、 制備高純氮?dú)猓僮鬟^(guò)程同（一）；將厭氧管固定到鐵架臺(tái)的夾子上并通氮?dú)猓谂囵B(yǎng)基
中加入5% Na2S•9H2O溶液，使其終濃度為0.5‰，用槍吸取適量培養(yǎng)基注入到厭氧管（或厭氧瓶中），通氣10-20S，塞上橡膠塞，旋緊蓋子。
3、 厭氧試管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可滅菌，121℃濕熱滅菌20min。 （四）厭氧菌固體培養(yǎng)基配制 1、 同（三）1。
2、 取上述培養(yǎng)基注入母液圓底燒瓶中（可以預(yù)先在圓底燒瓶外壁用記號(hào)筆劃上體積刻度），再
加瓊脂粉和適量蒸餾水以彌補(bǔ)在煮沸過(guò)程中蒸發(fā)的損失量。然后煮沸15-20mins，驅(qū)除培養(yǎng)基中的溶解氧。(應(yīng)特別注意：融化的固體培養(yǎng)基在沸騰時(shí)容易從燒瓶瓶口溢出引起電爐短路，從而將電爐燒壞)，在接近沸騰時(shí)要把電爐移開(kāi)。
3、 煮沸10分鐘后，開(kāi)始通高純氮?dú)猓粚捬豕芄潭ǖ借F架臺(tái)的夾子上并通氮?dú)猓尤?%
Na2S•9H2O溶液，使其終濃度為0.5‰。然后用10ml的定量注射針筒取5ml培養(yǎng)基注入15ml已換氣的厭氧試管中。（注意：因?yàn)槭枪腆w培養(yǎng)基，注射器活塞處容易被瓊脂粘住，使得封閉性較高，相對(duì)來(lái)說(shuō)不易變紅，但是也會(huì)有少許顏色，不用擔(dān)心，同樣加入少量硫化鈉到管子或者瓶子內(nèi)即可）。
4、 滅菌后的培養(yǎng)基取出來(lái)，就進(jìn)行滾管操作。使滅完菌還未冷卻的固體培養(yǎng)基在桌面勻速滾動(dòng)，
培養(yǎng)基會(huì)均勻固定在厭氧管壁上；也可以做成斜面狀，但是如果是分菌的話應(yīng)該是滾管更加好點(diǎn)，因?yàn)榻佑|面積大。**后，管底會(huì)留有稍許的冷凝水。
5、 注：如果是制備少量固體培養(yǎng)基，也可先在厭氧管中加入終濃度為2%的瓊脂后按液體培養(yǎng)
基的配制方法配制。滅好菌后，把瓊脂搖勻后滾管或擺斜面。 （五）厭氧菌分離純化
1、富集培養(yǎng)：用滅菌小鐵鍬鏟取0.5g-2.5g樣品**裝有20-25ml培養(yǎng)基的厭氧瓶?jī)?nèi)，充N(xiāo)2 ，塞
緊塞子，然后振蕩均勻，一定溫度下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)幾天后進(jìn)行稀釋涂布，方法在“直接涂布法”中有詳細(xì)介紹。 2、直接涂布法：
1）樣品梯度稀釋：取含9ml無(wú)氧無(wú)菌水的厭氧試管若干支，用無(wú)菌1ml定量注射器以10倍稀
釋法稀釋污泥菌懸液**合適濃度（稀釋度視樣品生長(zhǎng)情況而定, 要注意用1ml注射器與18#針頭結(jié)合時(shí)，1ml注射器的量程已經(jīng)不準(zhǔn)確，經(jīng)過(guò)移液槍的確定，0.7ml刻度處即相當(dāng)于1ml）。由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)富集所以樣品中含有的菌量較少，直接涂布法中菌懸液的稀釋度做到10-2就可以了；而富集后的菌液為得到單菌落，稀釋度一般要做到10-6。
2）涂布：用無(wú)菌1ml定量注射器取相應(yīng)稀釋度的污泥菌懸液0.2ml于含4.5ml的固體培養(yǎng)基的
厭氧試管中，立即滾管。滾管的要*是：注射器從梯度稀釋液轉(zhuǎn)移到滾管之內(nèi)后，塞緊塞子，將稀釋液均勻涂滾于厭氧管壁內(nèi)，然后再取出塞子，通無(wú)氧高氮?dú)怏w，用無(wú)菌注射器與無(wú)菌針頭將多余的液體（包括了原來(lái)的冷凝水與稀釋液）吸出來(lái)，可防止過(guò)多的水滯留導(dǎo)致滾管模糊、菌落不清。
3）培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時(shí)間看菌的生長(zhǎng)來(lái)定，有些只要兩三天，長(zhǎng)的需要十來(lái)天，這些可
以查其他科技工作者所做的相關(guān)屬菌株的條件來(lái)設(shè)定，一般如果條件合適，3天左右會(huì)有菌落長(zhǎng)出。
（六）厭氧菌菌落的觀察和純化
1、觀察 4d培養(yǎng)后，觀察厭氧試管內(nèi)壁上出現(xiàn)菌落；
2、純化 多次涂布滾管，挑單菌落純化，若在低稀釋度下形成了單克隆菌落，那么可以認(rèn)為其
已經(jīng)比較純，也可以做鑒定工作，比如簡(jiǎn)單染色觀察菌落形態(tài)是否一致等。
建議：
1. 將刃天青配成母液，母液濃度為1‰（W/V），4℃冰箱放置。
2、專性厭氧菌生長(zhǎng)于很低的氧化還原電勢(shì)下，其呼吸鏈末端電子受體為無(wú)機(jī)氧化物和有機(jī)氧化物的生物氧化，這是一類(lèi)在無(wú)氧或低氧條件下進(jìn)行的產(chǎn)能效率較低的呼吸形式。 3、刃天青的指示：刃天青在氧化態(tài)時(shí)呈紫絳色，在完全還原時(shí)為無(wú)色，它**步不可逆地還原為Resorufin, 呈現(xiàn)桃紅色，然后再可逆性地還原為無(wú)色的二氫Resorufin。如果制備的培養(yǎng)基呈現(xiàn)桃紅色，表明培養(yǎng)基已經(jīng)被氧化，氧還電位已升高。其還原指示電位為-42mv。
