厭氧性細菌的分離培養(yǎng)法 

 厭氧菌需有較低的氧化—還原勢能才能生長(例如破傷風梭狀芽孢桿菌需氧化—還原電勢降低**0.11V時才開始生長)，在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化—還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長。為使培養(yǎng)基降低勢，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的。現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主要有生物學，化學和物理學3種方法，可根據各實驗室的具體情況而選用。  1．生物學方法 

    培養(yǎng)基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等)或動物組織(新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等)，由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養(yǎng)基的應用，就是根據這個原理)，組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢下降。 

     另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個平皿內，利用需氧菌的生長將氧消耗后，使厭氧菌能生長。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強的需氧菌(如枯草桿菌)，另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。  2．化學方法 

    利用還原作用強的化學物質，將環(huán)境或培養(yǎng)基內的氧氣吸收，或用還原氧化型物質，降低氧化—還原電勢。 

 （１）李伏夫(B．M．JIbbob)法 

    此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣，其反應式如下： 

    Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02 

    取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(如系液體培養(yǎng)基，則直立于罐內)，**上端保留可容納1~2個平皿的空間(視玻罐的體積而定)，按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內水分過多。若用無蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉(如圖１－５)。  （２）焦性沒食子酸法 

 焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食橙(Purpurgallin)。每l00cm3空間用焦性沒食子酸1g及10％氫氧化納或氫氧化鉀l0ml，其具體方法主要有下列幾種：  1）單個培養(yǎng)皿法： 

 將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在其上放焦性沒食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于其上，周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人37C溫箱培養(yǎng)24~48h后，取出觀察。 

 2）Buchner氏試管法： 

 取一大試管，在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍封以石蠟，37培養(yǎng)24~48h后觀察(圖１－６)。  ３） 玻罐或干燥器法： 

 置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，并在玻罐內置美藍指示劑一管，從罐側加入氫氧化鈉溶液放于罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準備好后．將線放下，使焦性沒食子酸落人氫氧化納溶液中，立即將蓋蓋好；封緊，置溫箱中培養(yǎng)。  ４）瑞(Wright)氏法： 

 將已接種細菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后，塞人管中離培養(yǎng)基1~1．5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養(yǎng)(圖１－７)。  ５）史(Spray)氏法： 

 用圖１－８所示的厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置氫氧化鈉溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封完全，然后搖動底部，使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。  ６）平皿法： 

 置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養(yǎng)（圖１－９）。  ７）硫乙醇酸鈉法  

硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑，加入培養(yǎng)基中，能除去其中的氧或還原性物質，促使厭氧菌生長。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。  A．液體培養(yǎng)基法： 

 將細菌種人含0.1％的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24~48h后觀察，本培養(yǎng)基中加美藍液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍被還原成無色。  Ｂ．固體培養(yǎng)基法： 

 常采用特殊構造的Brewer培養(yǎng)皿，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長而形成孤立的菌落；操作過程是先將Brewer氏皿干熱滅菌，將溶化且冷卻**50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人皿內。待瓊脂冷   凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸（圖１－10)。此時皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍應逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故仍呈藍色。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內，經過24~48h后觀察。  3．物理學方法   #p#分頁標題#e#

 利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅除或隔jue環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長發(fā)育。    （１）厭氧罐法 

    常用的厭氧罐有Brewer氏罐，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐（圖１－11）。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣**大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個厭氧罐放人孵育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。  （２）真空干燥器法   

 將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中，開動抽氣機，抽**高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳氣體。將整個干燥器放進孵育箱培養(yǎng)。  （３）高層瓊脂法   

   加熱融化高層瓊脂，冷**45℃左右接種厭氧菌，迅速混合均勻。冷凝后37℃培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長。  （４）加熱密封法   

   將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內加熱l0min，驅除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無菌凡士林石蠟，置37℃培養(yǎng)。此外，尚有搖振培養(yǎng)法，此處從略。  （５）二氧化碳培養(yǎng)法 
少數(shù)細菌如布氏桿菌(牛型)等，孵育時，需大氣中添加5％~10％二氧化碳，方能使之生長繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；**簡單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內，燃點蠟燭，當火焰熄滅時，該缸的大氣中，就約增加了5％~10％的二氧化碳。也可用化學物質作用后生成二氧化碳，如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4％NaHCO3與30％H2SO4lmL，則可產生22.4mL的二氧化碳氣體。